Для изучения влияния температуры на скорость роста A. undina P2, питательный бульон дополняли солями морской воды и засевали ночной бульонной культурой (выращенной со встряхиванием при 25оC). Засеянный бульон распределяли по 200 мл в 4-е качалочные колбы объёмом по 700 мл и встряхивали при 150 об/мин при 13оC, 25оC, 30оC и 37оC. Через определенные интервалы времени стерильно отбирали пробы культуры и измеряли оптическую плотность при 550 нм.
Для получения колоний, 50 мкл пробы морской воды растирали по поверхности питательного агара, дополненного солями, содержащимися в морской воде (г/л): агар (Copenhagen Pectin A/S, Дания) ЂЂЂ 15; триптон (Organotechnie, Франция) - 10; дрожжевой экстракт (той же фирмы) ЂЂЂ 5; тиамин - 0.01; NaCl - 27.5; MgCl2 ЂЂЂ 5; MgSO4 ЂЂЂ 2; CaCl2 - 0.5; KCl ЂЂЂ 1; FeSO4 - 0.001; рН 7.2 - 7.7 [6]. После 2-х суток инкубации при 4oС выросло около 200 колоний, которые рассевали по 16 колоний на чашку, выращивали 20 ч при 24оC и использовали для определения фосфатаз и их термолабильности. Для этого 0.2-1 мг клеток с агара лизировали в 100 мкл 10 мМ трис-HCl (pH 7.7) с 0.2 мг/мл лизоцимом (Serva, Германия).
Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [6]. Определение штамма до вида проводили по определителю [7].
Целью данного исследования был поиск продуцента термолабильной щелочной фосфатазы. Поиск осуществлялся среди глубинных микроорганизмов в Авачинском заливе в районе острова Старичков.
Известно [4,5], что адаптация микроорганизмов к холодным условиям существования (так называемые психрофильные микроорганизмы) приводит к увеличению рыхлости и подвижности третичной структуры ферментов психрофилов, а это, в свою очередь, сказывается на термостабильности этих ферментов. В результате ферменты психрофилов оказываются зачастую гораздо более термолабильными, по сравнению с аналогичными ферментами мезофилов.
Библиотека научных трудов :: Новые ферменты Биотехнология, 2005, ЂЂЂ 2, с. 38-43 страницы : Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2 , В.С. Дедков, Ю.А. Антонова, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев * - автор для переписки Из природных изолятов нами был выделен продуцент термолабильной щелочной фосфатазы, идентифицированной как вид бактерии Alteromonas undina P2. Описан способ очистки фермента. Определены оптимальные условия действия щелочной фосфатазы: 0.1 М глицин-NaOH pH 9.5, 10 мМ MgCl2 и 0.1 мМ ZnCl2. Фермент наиболее активен при 30оC. При 6оC уровень активности щелочной фосфатазы превышает 50% от максимальной. Прогревание ферментного препарата в течение 20 мин при 65о приводит к полной необратимой инактивации фосфатазы. Щелочные фосфатазы (EC 3.1.3.1) широко распространены в природе. Эти ферменты широкого субстратного спектра действия осуществляют каталитическое удаление фосфатной группы как со многих небольших органических молекул, так и с больших биомолекул, таких как ДНК и белки [1]. Щелочные фосфатазы обычно используются в молекулярной биологии и при проведении медицинских биохимических анализов. В молекулярной биологии фосфатазы применяются для удаления концевых фосфатных групп с молекул нуклеиновых кислот [2]. Наиболее существенными свойствами фосфатаз, для этих целей, являются высокая каталитическая активность и термолабильность ферментов, последнее позволяет легко инактивировать фосфатазную активность термической денатурацией без использования достаточно сложных процедур экстракции и осаждения [3].
Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2
Комментариев нет:
Отправить комментарий